Chromatin condensation during Drosophila spermiogenesis and decondensation after fertilization.

Eine typische Eigenschaft der männlichen Keimzellen ist die Kondensation des Chromatins. Während in Säugern bekannt ist, dass in der Spermiogenese die Histone zuerst durch Transitionsproteine und dann durch Protamine ersetzt werden, ist in Drosophila wenig darüber bekannt. Im Folgenden charakterisiere ich die drei testisspezifisch exprimierten Drosophila Gene Mst35Ba, Mst35Bb und Mst77F. Mit eGFP Fusionsproteinen zeige ich, dass Mst35Ba und Mst35Bb tatsächlich für dProtA (Drosophila ProtaminA) beziehungsweise dProtB (Drosophila ProtaminB) kodieren und eine Identität von 94% zueinander zeigen. Die Protamine von Drosophila sind beträchtlich größer als die der Säuger, enthalten aber ebenfalls beide typische Cystein/Arginin Blöcke. Die ektopische Expression von dProtA und dProtB in den Speicheldrüsen führt zur ausschließlichen Lokalisation dieser Proteine im Kern. Beide Protamine binden an die Polytänchromosomen ohne irgendeine Präferenz für das Eu- oder Heterochromatin, was das Bindeverhalten der Protamine in den Kernen der Spermien widerspiegelt. Anders als in Säugern sind die Protamingene von Drosophila nicht haploinsufficient. Bei der Durchmusterung der Mutantenkollektion aus dem Zuker-Labor konnte keine Mutation in einem der beiden Protamingene gefunden werden, was für eine funktionelle Redundanz spricht. Mst77F kodiert für ein spermatidenspezifisches Linker-Histon-ähnliches Protein. Das Expressionsmuster von Mst77F deckt sich mit dem der Protamine. Mst77F zeigt große Ähnlichkeit zum Säugerprotein HILS1. ProtaminA-eGFP, ProtaminB-eGFP und Mst77F-eGFP tragende transgene Drosophila-Linien zeigen, dass diese Proteine zu wichtigen chromosomalen Proteinbestandteilen ab dem Kanustadium elongierender Spermatiden und in den Kernen reifer Spermien werden, während His2AvDGFP im Kanustadium abgebaut wird. Der Übergang von der nukleosomalen zu der auf Protaminen basierenden Chromatinkonfiguration findet also im Kanustadium der Spermatidenentwicklung statt. Mst77F Mutanten (ms(3)nc3) zeichnen sich durch kleine runde Kerne aus und sind männlich steril. Diese Daten lassen vermuten, dass der generelle Mechanismus der Chromatinkondensierung in Drosophila mit dem in Säugern vergleichbar ist. Während des Kanustadiums der Spermatidenentwicklung wird Histon H2AvD abgebaut. Im Folgenden zeige ich eine neue Funktion von UbcD1, einem E2-Ubiquitin konjugierenden Enzym, das für den Abbau von H2AvD nötig ist. Auch die E3 Ligasen Cullin-1 und Cullin-3 werden beide während der Drosophila Spermatogenese exprimiert. Cullin-1 wird in allen frühen Keimzellen in den Fusomen exprimiert und während der Meiose abgebaut. In späteren Stadien wird Cullin-1 erneut exprimiert und ist während des Kanustadiums der Spermatidendifferenzierung im perinuklearen Bereich lokalisiert. Cullin-3 wird in den elongierten Spermatiden exprimiert. Während der frühen Befruchtungsstadien enthält der väterliche Pronukleus noch Protamine und Mst77F, gewinnt aber vor der Zygotenbildung eine nukleosomale Konfiguration. In den von Sesame-mutanten Weibchen gelegten Eiern behält der väterliche Pronukleus die auf Protaminen basierende Chromatinkonfiguration bei, während Mst77F-eGFP entfernt wird. Dies deutet darauf hin, dass das sesame Genprodukt (HIRA) für den Abbau der Protamine essentiell ist, während der Abbau von Mst77F unabhängig von Sesame erfolgt

Chromatin condensation during Drosophila spermiogenesis and decondensation after fertilization.

Eine typische Eigenschaft der männlichen Keimzellen ist die Kondensation des Chromatins. Während in Säugern bekannt ist, dass in der Spermiogenese die Histone zuerst durch Transitionsproteine und dann durch Protamine ersetzt werden, ist in Drosophila wenig darüber bekannt. Im Folgenden charakterisiere ich die drei testisspezifisch exprimierten Drosophila Gene Mst35Ba, Mst35Bb und Mst77F. Mit eGFP Fusionsproteinen zeige ich, dass Mst35Ba und Mst35Bb tatsächlich für dProtA (Drosophila ProtaminA) beziehungsweise dProtB (Drosophila ProtaminB) kodieren und eine Identität von 94% zueinander zeigen. Die Protamine von Drosophila sind beträchtlich größer als die der Säuger, enthalten aber ebenfalls beide typische Cystein/Arginin Blöcke. Die ektopische Expression von dProtA und dProtB in den Speicheldrüsen führt zur ausschließlichen Lokalisation dieser Proteine im Kern. Beide Protamine binden an die Polytänchromosomen ohne irgendeine Präferenz für das Eu- oder Heterochromatin, was das Bindeverhalten der Protamine in den Kernen der Spermien widerspiegelt. Anders als in Säugern sind die Protamingene von Drosophila nicht haploinsufficient. Bei der Durchmusterung der Mutantenkollektion aus dem Zuker-Labor konnte keine Mutation in einem der beiden Protamingene gefunden werden, was für eine funktionelle Redundanz spricht. Mst77F kodiert für ein spermatidenspezifisches Linker-Histon-ähnliches Protein. Das Expressionsmuster von Mst77F deckt sich mit dem der Protamine. Mst77F zeigt große Ähnlichkeit zum Säugerprotein HILS1. ProtaminA-eGFP, ProtaminB-eGFP und Mst77F-eGFP tragende transgene Drosophila-Linien zeigen, dass diese Proteine zu wichtigen chromosomalen Proteinbestandteilen ab dem Kanustadium elongierender Spermatiden und in den Kernen reifer Spermien werden, während His2AvDGFP im Kanustadium abgebaut wird. Der Übergang von der nukleosomalen zu der auf Protaminen basierenden Chromatinkonfiguration findet also im Kanustadium der Spermatidenentwicklung statt. Mst77F Mutanten (ms(3)nc3) zeichnen sich durch kleine runde Kerne aus und sind männlich steril. Diese Daten lassen vermuten, dass der generelle Mechanismus der Chromatinkondensierung in Drosophila mit dem in Säugern vergleichbar ist. Während des Kanustadiums der Spermatidenentwicklung wird Histon H2AvD abgebaut. Im Folgenden zeige ich eine neue Funktion von UbcD1, einem E2-Ubiquitin konjugierenden Enzym, das für den Abbau von H2AvD nötig ist. Auch die E3 Ligasen Cullin-1 und Cullin-3 werden beide während der Drosophila Spermatogenese exprimiert. Cullin-1 wird in allen frühen Keimzellen in den Fusomen exprimiert und während der Meiose abgebaut. In späteren Stadien wird Cullin-1 erneut exprimiert und ist während des Kanustadiums der Spermatidendifferenzierung im perinuklearen Bereich lokalisiert. Cullin-3 wird in den elongierten Spermatiden exprimiert. Während der frühen Befruchtungsstadien enthält der väterliche Pronukleus noch Protamine und Mst77F, gewinnt aber vor der Zygotenbildung eine nukleosomale Konfiguration. In den von Sesame-mutanten Weibchen gelegten Eiern behält der väterliche Pronukleus die auf Protaminen basierende Chromatinkonfiguration bei, während Mst77F-eGFP entfernt wird. Dies deutet darauf hin, dass das sesame Genprodukt (HIRA) für den Abbau der Protamine essentiell ist, während der Abbau von Mst77F unabhängig von Sesame erfolgt

Dumpy-30 family members as determinants of male fertility and interaction partners of metal-responsive transcription factor 1 (MTF-1) in Drosophila

BACKGROUND: Metal-responsive transcription factor 1 (MTF-1), which binds to metal response elements (MREs), plays a central role in transition metal detoxification and homeostasis. A Drosophila interactome analysis revealed two candidate dMTF-1 interactors, both of which are related to the small regulatory protein Dumpy-30 (Dpy-30) of the worm C. elegans. Dpy-30 is the founding member of a protein family involved in chromatin modifications, notably histone methylation. Mutants affect mating type in yeast and male mating in C. elegans. RESULTS: Constitutive expression of the stronger interactor, Dpy-30L1 (CG6444), in transgenic flies inhibits MTF-1 activity and results in elevated sensitivity to Cd(II) and Zn(II), an effect that could be rescued by co-overexpression of dMTF-1. Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) suggest that Dpy-30L1 interferes with the binding of MTF-1 to its cognate MRE binding site. Dpy-30L1 is expressed in the larval brain, gonads, imaginal discs, salivary glands and in the brain, testes, ovaries and salivary glands of adult flies. Expression of the second interactor, Dpy-30L2 (CG11591), is restricted to larval male gonads, and to the testes of adult males. Consistent with these findings, dpy-30-like transcripts are also prominently expressed in mouse testes. Targeted gene disruption by homologous recombination revealed that dpy-30L1 knockout flies are viable and show no overt disruption of metal homeostasis. In contrast, the knockout of the male-specific dpy-30L2 gene results in male sterility, as does the double knockout of dpy-30L1 and dpy-30L2. A closer inspection showed that Dpy-30L2 is expressed in elongated spermatids but not in early or mature sperm. Mutant sperm had impaired motility and failed to accumulate in sperm storage organs of females. CONCLUSION: Our studies help to elucidate the physiological roles of the Dumpy-30 proteins, which are conserved from yeast to humans and typically act in concert with other nuclear proteins to modify chromatin structure and gene expression. The results from these studies reveal an inhibitory effect of Dpy-30L1 on MTF-1 and an essential role for Dpy-30L2 in male fertility

RNA from a simple-tandem repeat is required for sperm maturation and male fertility in Drosophila melanogaster.

Tandemly-repeated DNAs, or satellites, are enriched in heterochromatic regions of eukaryotic genomes and contribute to nuclear structure and function. Some satellites are transcribed, but we lack direct evidence that specific satellite RNAs are required for normal organismal functions. Here, we show satellite RNAs derived from AAGAG tandem repeats are transcribed in many cells throughout Drosophila melanogaster development, enriched in neurons and testes, often localized within heterochromatic regions, and important for viability. Strikingly, we find AAGAG transcripts are necessary for male fertility, and that AAGAG RNA depletion results in defective histone-protamine exchange, sperm maturation and chromatin organization. Since these events happen late in spermatogenesis when the transcripts are not detected, we speculate that AAGAG RNA in primary spermatocytes 'primes' post-meiosis steps for sperm maturation. In addition to demonstrating essential functions for AAGAG RNAs, comparisons between closely related Drosophila species suggest that satellites and their transcription evolve quickly to generate new functions

The Homeodomain Protein Defective Proventriculus Is Essential for Male Accessory Gland Development to Enhance Fecundity in Drosophila

The Drosophila male accessory gland has functions similar to those of the mammalian prostate gland and the seminal vesicle, and secretes accessory gland proteins into the seminal fluid. Each of the two lobes of the accessory gland is composed of two types of binucleate cell: about 1,000 main cells and 40 secondary cells. A well-known accessory gland protein, sex peptide, is secreted from the main cells and induces female postmating response to increase progeny production, whereas little is known about physiological significance of the secondary cells. The homeodomain transcriptional repressor Defective proventriculus (Dve) is strongly expressed in adult secondary cells, and its mutation resulted in loss of secondary cells, mononucleation of main cells, and reduced size of the accessory gland. dve mutant males had low fecundity despite the presence of sex peptide, and failed to induce the female postmating responses of increased egg laying and reduced sexual receptivity. RNAi-mediated dve knockdown males also had low fecundity with normally binucleate main cells. We provide the first evidence that secondary cells are crucial for male fecundity, and also that Dve activity is required for survival of the secondary cells. These findings provide new insights into a mechanism of fertility/fecundity

The NSL Complex Regulates Housekeeping Genes in Drosophila

MOF is the major histone H4 lysine 16-specific (H4K16) acetyltransferase in mammals and Drosophila. In flies, it is involved in the regulation of X-chromosomal and autosomal genes as part of the MSL and the NSL complexes, respectively. While the function of the MSL complex as a dosage compensation regulator is fairly well understood, the role of the NSL complex in gene regulation is still poorly characterized. Here we report a comprehensive ChIP–seq analysis of four NSL complex members (NSL1, NSL3, MBD-R2, and MCRS2) throughout the Drosophila melanogaster genome. Strikingly, the majority (85.5%) of NSL-bound genes are constitutively expressed across different cell types. We find that an increased abundance of the histone modifications H4K16ac, H3K4me2, H3K4me3, and H3K9ac in gene promoter regions is characteristic of NSL-targeted genes. Furthermore, we show that these genes have a well-defined nucleosome free region and broad transcription initiation patterns. Finally, by performing ChIP–seq analyses of RNA polymerase II (Pol II) in NSL1- and NSL3-depleted cells, we demonstrate that both NSL proteins are required for efficient recruitment of Pol II to NSL target gene promoters. The observed Pol II reduction coincides with compromised binding of TBP and TFIIB to target promoters, indicating that the NSL complex is required for optimal recruitment of the pre-initiation complex on target genes. Moreover, genes that undergo the most dramatic loss of Pol II upon NSL knockdowns tend to be enriched in DNA Replication–related Element (DRE). Taken together, our findings show that the MOF-containing NSL complex acts as a major regulator of housekeeping genes in flies by modulating initiation of Pol II transcription

Drosophila MCRS2 Associates with RNA Polymerase II Complexes To Regulate Transcription▿

Drosophila MCRS2 (dMCRS2; MCRS2/MSP58 and its splice variant MCRS1/p78 in humans) belongs to a family of forkhead-associated (FHA) domain proteins. Whereas human MCRS2 proteins have been associated with a variety of cellular processes, including RNA polymerase I transcription and cell cycle progression, dMCRS2 has been largely uncharacterized. Recent data show that MCRS2 is purified as part of a complex containing the histone acetyltransferase MOF (males absent on first) in both humans and flies. MOF mediates H4K16 acetylation and regulates the expression of a large number of genes, suggesting that MCRS2 could also have a function in transcription regulation. Here, we show that dMCRS2 copurifies with RNA polymerase II (RNAP II) complexes and localizes to the 5′ ends of genes. Moreover, dMCRS2 is required for optimal recruitment of RNAP II to the promoter regions of cyclin genes. In agreement with this, dMCRS2 is required for normal levels of cyclin gene expression. We propose a model whereby dMCRS2 promotes gene transcription by facilitating the recruitment of RNAP II preinitiation complexes (PICs) to the promoter regions of target genes